比較日本 1  型糖尿病患者放射免疫測定法和酶聯免疫吸附測定法的胰島素瘤相關抗原 2   自

身抗體的臨床意義和抗原特異性

川崎英二、 1 島田晃、 2 今川明久、 3 阿比留夫、4 粟田拓哉、 5  及川洋 一 、 2 大澤春 彥、 6  川端由美子、 7  小澤潤二、 8 小林哲朗、 9 高橋和馬、 10  中條大輔、 11 友福井 康、 12 三浦淳之介、 13 安田和樹、 14 安田久文、 15  梶尾博、 16 花房 敏明 、 17池  上 博、 7 與 日本糖尿病學會 1  型糖尿病委員會

目標/簡介

本研究旨在通過放射免疫分析（RIA；IA-2A-RIA）和酶聯免疫吸附分析（ELISA；IA-2A-ELISA） 探討胰島素瘤相關抗原 2（IA-2A） 自身抗體的臨床意義和抗原特異性。 ）在日本 1  型糖

尿病患者中。

材料和方法

共有 338  名 1  型糖尿病患者入組，其中 38  名暴發性 1  型糖尿病、168  名急性發作 1   型糖尿病和 137  名緩慢進展 1  型糖尿病 (SPIDDM)。檢查了自身抗體滴度的一致性、相關 性以及 IA-2A  與胰島素缺乏狀態進展之間的關系。此外，還使用競爭性測定來檢查抗原特

異性。

結果

在急性發作的 1  型糖尿病和 SPIDDM   中，IA-2A-ELISA   的患病率比 IA-2A-RIA  低 4-5%， 但與谷氨酸脫羧酶聯合測量時，兩種亞型的診斷敏感性均較高自身抗體，具有可比性。使用

RIA  或 ELISA  方法診斷 1  型糖尿病與 RIA  和 ELISA  檢測到的自身抗體滴度的指數相關

性基本一致。在 SPIDDM  患者中，ELISA  法（而非 RIA  法）IA-2A   陽性病例的空腹 C  肽 顯著低于陰性病例（ P < 0.05 ） 。此外，IA-2A-ELISA  在預測 SPIDDM  胰島素缺乏進展方 面優于 RIA  方法。競爭性分析表明，即使 RIA  和 ELISA  結果不一致的血清也含有 IA-2  特

異性自身抗體。

結論

這些結果表明，IA-2A-ELISA  不僅是診斷 1  型糖尿病的可靠標志物，而且還可用于預測未 來的胰島素依賴性；也就是說，IA-2A-ELISA  檢測有助于識別可能進展為胰島素缺乏狀態的

SPIDDM  患者亞型。

關鍵詞： 自身抗體、 自身抗原、胰島素瘤相關抗原 2 、1  型糖尿病

在本研究中，我們表明，RSR Ltd.（英國卡迪夫）對胰島素瘤相關抗原 2   自身抗體 (IA-2A)  進行的放射免疫測定 (RIA)  和酶聯免疫吸附測定 (ELISA)  的一致性為 94.7%暴發性 1  型 糖尿病( κ  統計量 = 0.000，95%  置信區間 0.000–0.000），急性發作 1  型糖尿病為 89.3%          ( κ  統計量 = 0.786，95%  置信區間 0.693–0.879），緩慢進展型 90.5% 1  型糖尿病( κ  統 計量 = 0.769 ，95%  置信區間 0.651–0.888）， 以及與谷氨酸脫羧酶自身抗體聯合測量時，

RIA  和 ELISA  方法對自身免疫介導的 1  型糖尿病的診斷敏感性相當。此外，我們報道，

RSR IA-2A-ELISA  比 RSR IA-2A-RIA  在識別可能進展為胰島素缺乏狀態的緩慢進展 1  型

糖尿病患者的亞型方面更有用。

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介紹

胰島素瘤相關抗原 2 (IA-2A)   自身抗體是預測和診斷 1  型糖尿病的重要血清學標志物。糖 尿病自身抗體標準化計劃或胰島自身抗體標準化計劃的制定是為了標準化和提高實驗室的  抗胰島自身抗體檢測性能1, 2  。在參與這些標準化計劃的實驗室中，放射性配體結合測 定在檢測 IA-2A 2  方面表現出顯著的一致性，同時也開發了各種方法學改進。這些方法包 括 RSR Ltd.（英國卡迪夫）的放射免疫測定 (RIA)  和酶聯免疫吸附測定 (ELISA) ，這兩種 方法都是用于分析 IA-2A  的成熟測試，并作為商業試劑盒在世界各地廣泛分布。這些試劑 盒已被證明表現良好，在糖尿病自身抗體標準化計劃 IA-2A  研討會上實現了高靈敏度和特 異性1  。最近， 日本 IA-2A 測量已從 RSR-RIA 轉向 RSR-ELISA ，因此有必要改變解釋和對 應關系，包括 RIA 方法的陽性/陰性判斷。因此，我們將本研究作為日本糖尿病協會 1  型  糖尿病委員會的一個研究項目進行，旨在調查使用 RSR-RIA  和 RSR  測量 IA-2A  值不一致 的日本 1  型糖尿病患者的臨床特征-ELISA。此外，我們進行了競爭性測定，以評估 RSR-RIA

和 RSR-ELISA  之間 IA-2A  結果的差異是否是由于非特異性結合造成的。

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材料和方法                                                                       

參加者

通過日本糖尿病協會委員會和日本 1  型糖尿病數據庫 (TIDE-J)  研究，從 10  個參與本研

究的機構收集了總共 343  份 1  型糖尿病患者的血清樣本。TIDE-J  研究的納入標準之前已 描述過3  。這項研究包括 38  名暴發性 1  型糖尿病患者、168  名急性發作 1  型糖尿病患

者和 137  名緩慢進展 1  型糖尿病 (SPIDDM)  患者，1  型糖尿病的診斷是根據委員會制定 的標準做出的。 日本糖尿病學會4, 5, 6  。患者臨床特征詳情見表1 。如果患者在病程中

的任何時間谷氨酸脫羧酶自身抗體（GADA）和/或胰島細胞抗體呈陽性，則診斷為 SPIDDM， 無論研究時的抗胰島自身抗體狀態如何。25  名 SPIDDM  患者在診斷時發現糖尿病酮癥酸  中毒，包括軟飲料酮癥（酮癥酸中毒）。研究方案得到了日本糖尿病學會倫理委員會和參與

該項目的各機構的批準，并獲得了所有參與者的知情同意。血清樣本保存在-20°C 直至使用。

表格 1

臨床特點

BMI ，身體質量指數；DKA ，糖尿病酮癥酸中毒；GADA ，谷氨酸脫羧酶自身抗體；F-CPR，

空腹 C 肽；HLA ，人類白細胞抗原；RIA ，放射免疫分析；SPIDDM ，緩慢進展的1型糖尿

抗胰島自身抗體測定

RSR-RIA IA-2A (IA-2A-RIA)  通過液相 RIA  測定，使用 125 I  標記的重組人 IA-2  作為示蹤 劑，如前所述7  。結果是從使用校準品在同一運行中構建的校準曲線中讀取的，并以 U/mL

表示。IA-2A-RIA  的截止值為 0.4 U/mL 。如前所述，RSR-ELISA IA-2A (IA-2A-ELISA)  和

GADA  分別使用生物素化 IA-2  和 GAD65  使用二價 ELISA  進行測定8  。結果是從使用校

準品在同一運行中構建的校準曲線中讀取的，并以 U/mL  表示。IA-2A-ELISA  和 GADA   的

截止值分別為 0.6 U/mL  和 5.0 U/mL 。IA-2A-RIA   的分析內和分析間變異系數分別為

2.5–2.8%  和 3.8– 5.3% ，而 IA-2A-ELISA   的分析內和分析間變異系數分別為 2.0– 3.3%  和 4.0–6.5% 9  。在 2018  年胰島自身抗體標準化計劃研討會（實驗室 ID：1801）中，IA-2A 的檢測靈敏度和特異性分別為 72%  和 98% ，GADA   的檢測靈敏度和特異性分別為 90%

和 98%。

競爭分析

通過使用未標記的重組人 IA-2  的競爭性結合實驗來檢查抗原特異性。檢測格式與 RSR-RIA 和 RSR-ELISA  相同。最初，為了確定重組 IA-2  蛋白的最佳量，將五種高水平 IA-2A  血清

與三種不同濃度的未標記 IA-2（從 2.5 μg  到 250 μg/mL  不等）在室溫下孵育 1  小時，

在進行 IA-2A  測量之前（圖S1）。基于該初步實驗，使用 250 μg/mL  未標記的 IA-2  蛋 白進行了進一步的競爭測定。添加重組 IA-2  蛋白后表現出抑制作用的血清樣品的百分比按

下式計算：[（不含競爭劑的 U/mL -  含競爭劑的 U/mL）/不含競爭劑的 U/mL] × 100。

統計分析

所有結果均表示為平均值±標準差或中位數（范圍），并在適當的情況下使用 χ 2 檢驗和

Fisher  精確檢驗對分類變量進行比較。使用 Mann–Whitney U 檢驗或 Kruskal –Wallis  檢驗  檢驗非參數數據的差異，并使用 Spearman  等級相關檢驗分析自身抗體滴度之間的相關性。 使用各種回歸模型進行曲線擬合分析，包括線性、二次、指數和倒數模型，以確定適合  IA-2A-RIA  水平和 IA-2A-ELISA  水平之間的相關性，以及持續時間之間的相關性。 SPIDDM  和自身抗體水平。根據 IA-2A  的 RIA/ELISA  結果將患者分為四組，如下： 第 1  組（RIA  陽性/ELISA  陽性）；第 2  組（RIA   陽性/ELISA  陰性）；第 3  組（RIA   陰性/ELISA  陽性）； 和第 4  組（RIA   陰性/ELISA   陰性）。IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之間的一致性通過 κ  統 計量進行評估，該統計量是從 0  到 1 10  范圍內一致性強度的度量。還進行了多元邏輯回

歸分析，評估 IA-2A  陽性與臨床和免疫遺傳學參數之間的關聯。P 值<0.05 被認為具有統計 學意義。本研究的統計分析是使用 StatView  統計軟件（5.0  版；SAS Institute ，卡里，北  卡羅來納州，美國）和 SigmaPlot  軟件（14.5  版；Systat Software Inc. ，圣何塞，加利福

尼亞州，美國）進行的。

IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 的患病率和一致性

暴發性 1  型糖尿病各亞型的 IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  患病率分別為 0  和 5%，急性發 作 1  型糖尿病為 51%  和 46% ，SPIDDM  為 31%  和 27% 。因此，在急性發作的 1  型  糖尿病和 SPIDDM  中，IA-2A-ELISA  的患病率比 IA-2A-RIA   的患病率低 4-5% 。然而，當 與 GADA（日本健康保險下第一個測量的抗胰島自身抗體）聯合測量時，RIA  和 ELISA  方 法對自身免疫介導的 1  型糖尿病的診斷敏感性相當（圖 S2 ）。急性發作 1  型糖尿病和  SPIDDM  中 IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之間的一致性如圖所示1。兩種亞型中大約 7%  和 3%  的患者分別僅 IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  呈陽性。此外，對于暴發性 1  型糖尿病，

IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之間的一致性為 94.7%( κ  統計數據 = 0.000，95% 95%  置信

區間 0.000–0.000），對于暴發性 1  型糖尿病，一致性為 89.3%( κ  統計數據 = 0.786，

急性發作 1  型糖尿病為 95%（95%  置信區間 0.693–0.879），SPIDDM  為 90.5%( κ  統 計量 = 0.769 ，95%  置信區間 0.651–0.888；表2）。使用線性和非線性回歸進行曲線擬合 分析，以確定哪個適合 IA-2A-RIA  水平和 IA-2A-ELISA  水平之間的相關性（表 S1 ）。 在急性發作的 1  型糖尿病和 SPIDDM   中，指數回歸模型比其他模型更適合（圖2a,b）。我

們還分別對 IA-2A-RIA <20 U/mL  范圍的患者進行了相同的分析，指數回歸曲線仍然適合 兩種亞型（圖 S3 ）。

(a)急性發作型1型糖尿病和(b)緩慢進展型糖尿病患者放射免疫測定(RIA)和酶聯免

疫吸附測定(ELISA)檢測胰島素瘤相關抗原2(IA-2A)結果的一致性 1糖尿病。

表 2

放射免疫測定的胰島素瘤相關抗原2與酶聯免疫吸附測定1型糖尿病血清的胰島素瘤相

關抗原2之間的一致性

1 型糖尿病患者

暴發性 1 型糖尿 病

急性發作的 1 型 糖尿病

SPIDDM

放射免疫分析 n    (+)

38     0 (0%)

168    85 (51%)

137    42 (31%)

酶聯免疫吸附測

定 (+)           協議   κ 統計（95% CI）

2 (5%)      94.7% 0.000（0.000 –0.000）

77 (46%)     89.3%         0.786

(0.693 –0.879)

37 (27%)     90.5%         0.769

(0.651 –0.888)

CI ，置信區間；ELISA ，酶聯免疫吸附測定；RIA ，放射免疫分析；SPIDDM ，緩慢進展的1

(a)急性發作型1型糖尿病和(b)緩慢進展型糖尿病患者中放射免疫測定(RIA)和酶聯

免疫吸附測定(ELISA)測定的胰島素瘤相關抗原2(IA-2A)水平之間的相關性 1糖尿病。

本分析中使用了任一測定的自身抗體陽性血清。

基于 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 陽性的急性發作 1   型糖尿病患者的臨床和免疫遺傳學特征

桌子3根據 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 的陽性或陰性結果，總結了四組急性發病 1 型糖尿病 患者的臨床和免疫遺傳學特征。四組之間在性別、發病年齡、糖尿病病程、發病時糖尿病酮 癥酸中毒患病率、體重指數、空腹 C 肽（F-CPR）水平、平均 GADA 水平和疾病頻率方面沒

有顯著差異易感 HLA-DRB1*04:05  和 -DRB1*09:01 。然而，四組之間的 GADA  患病率存

在    顯著差異。在 IA-2A-RIA  陽性 ( P  = 0.0047)  和 IA-2A-ELISA   陽性患者 ( P  =

0.0039)中觀察到 GADA  患病率顯著較高。此外，第 1  組 (RIA + /ELISA +)的平均 IA-2A

水平顯著高于第 2  組 (RIA + /ELISA - )  或第 3  組 (RIA - /ELISA + )。

表 3

168例急性發作1型糖尿病患者的臨床特征（按組別）

第 3 組

（RIA 陰

第 1 組（RIA   第 2 組（RIA    性且        第 4 組（RIA

陽性和 ELISA   陽性且 ELISA   ELISA 陽    陰性和

陽性）          陰性）          性）        ELISA 陰性）  P 值

n                72               13               5           78

女性            46 (64%)        8 (62%)         4 (80%)     43 (55%)      NS

發病年齡（歲） 39.0±18.4     43.1±19.8     48.4±22.5 42.0±16.5   NS

持續時間（年） 3.3±4.2        2.0±2.9        2.0±2.4   4.4±7.2     NS

發病時 DKA      50/22           12 月 1 日       3/2         53/25         NS

(+/-)

體重指數（公斤/ 21.0±3.3       20.1±2.3       21.5±6.0  20.8±3.0    NS

米 2）

F-CPR (ng/mL)  0.53±0.46     0.36±0.28      1.03±1.28 0.64±0.81   NS

嘎達 (+)        64 (89%)        9 (69%)         3 (60%)     53 (68%)      0.015

伽達 (U/mL)     1,000.8±906.5 929.4±1,017.0 748.8 ±   690.7±807.2 NS

1,086.8

IA-2A-RIA       9.9±11.4       1.6±1.0        不適用      不適用        <0.0001

(U/mL)

IA-2A-ELISA     153.2±427.4   不適用          1.6±1.0   不適用        0.012

(U/mL)

HLA-DRB1*04:05 25/112 (26%)   5/14 (36%)      1/6 (17%)  30/120 (25%) NS

(+)

HLA-DRB1*09:01 36/112 (40%)   4/14 (29%)      2/6 (33%)  30/120 (25%) NS

(+)

測定相應自身抗體陽性患者的自身抗體水平。

BMI ，身體質量指數；DKA ，糖尿病酮癥酸中毒；ELISA ，酶聯免疫吸附測定；F-CPR ，空腹

C 肽；GADA，谷氨酸脫羧酶自身抗體；HLA，人類白細胞抗原；RIA，放射免疫分析；SPIDDM，

緩慢進展的1型糖尿?。?/span>NS ，不顯著。

基于 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 陽性的 SPIDDM 患者的臨床和免疫遺傳學特征

桌子4顯示四組 SPIDDM  患者的臨床和免疫遺傳學特征。值得注意的是，第 4  組的糖尿病

病程明顯長于第 1  組，并且四組之間的 F-CPR  水平也有顯著差異。IA-2A-ELISA  陽性

SPIDDM  患者的 F-CPR  顯著低于 IA-2A-ELISA   陰性患者（表S2 ，P  = 0.006）。然而，

IA-2A-RIA  陽性和陰性患者的 F-CPR  水平沒有差異。同樣，與急性發作的 1  型糖尿病結果

一樣，四組中 GADA  的患病率存在    顯著差異，并且第 1  組的平均 IA-2A  水平 (RIA +

/ELISA + )  顯著高于第 2 組(RIA + /ELISA - )  或第 3  組 (RIA - /ELISA + )。對于 II  類 HLA，

IA-2A-ELISA  陽性患者中 HLA-DRB1*04:05  和 DRB1*09:01  等位基因頻率分別為 32%

(19/60)  和 62% (34/60) ，31 IA-2A   陰性患者中分別為 % (42/134)  和 30% (40/134) 。  因此，HLA-DRB1*09:01（而非 DRB1*04:05）僅與 IA-2A-ELISA  陽性相關（P = 0.0004）。 調整臨床和免疫遺傳學參數（發病年齡、性別、持續時間、GADA  陽性和 HLA-DRB1*09:01  的存在）后，IA-2A-ELISA  陽性相關，但 IA-2A-RIA  陽性不相關，HLA-DRB1*09:01  仍然

顯著（表S3）。

表 4

137例緩慢進展1型糖尿病患者的臨床特征（按組）

第 1 組（RIA  第 2 組（RIA  第 3 組（RIA   第 4 組（RIA

陽性和 ELISA  陽性且        陰性且 ELISA   陰性和

陽性）         ELISA 陰性）  陽性）         ELISA 陰性）  P 值

F-CPR (ng/mL)  0.91±0.81     1.76±1.88   0.53±0.27     1.70±1.46** 0.042

嘎達 (+)        32 (97%)       5 (56%)       3 (75%)        45 (49%)      <0.0001

伽達 (U/mL)     1191.3±950.0 134.4±169.3 800.8±1053.8 658.8±847.6 NS

IA-2A-RIA       12.2±10.3     1.0±0.4      不適用         不適用        <0.0001

(U/mL)

IA-2A-ELISA    95.7±178.4   不適用        1.4±0.8       不適用        0.030

(U/mL)

HLA-DRB1*04:05 19/56 (34%)   8/16 (50%)   0/4 (0%)       34/118 (29%) NS

(+)

HLA-DRB1*09:01 31/56 (55%)   2/16 (13%)   3/4 (75%)      38/118 (32%) <0.0001

(+)

測定相應自身抗體陽性患者的自身抗體水平。

BMI ，身體質量指數；DKA ，糖尿病酮癥酸中毒；ELISA ，酶聯免疫吸附測定；F-CPR ，空腹

C 肽；GADA ，谷氨酸脫羧酶自身抗體；HLA ，人類白細胞抗原；不適用，不適用；NS ，不

顯著；RIA ，放射免疫分析。

雖然患者在糖尿病病程中應至少有一種自身抗體（主要是 GADA）來診斷 SPIDDM ，但在病 程較長的患者中，一些自身抗體可能會消失。因此，我們研究了 SPIDDM  患者病程與自身

抗體患病率和水平之間的關系。GADA 的患病率高于 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA ，并且在整

個病程中緩慢下降。IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之間的陽性率隨疾病持續時間的下降相似 （圖3）。因此，對于病程≥5 年的患者，SPIDDM 的診斷敏感性下降至 51% 。 自身抗體陽

性患者的病程與自身抗體水平之間沒有關聯（圖S4）。

緩慢進展1型糖尿病患者抗胰島自身抗體陽性與糖尿病病程的相關性。ELISA ，酶聯免疫

吸附測定；GADA，谷氨酸脫羧酶自身抗體；RIA，放射免疫分析。*與1-2年組相比，P< 0.05；

** 與<1 、1-2和3-5歲組相比，P<0.05 。

SPIDDM 患者進展為胰島素缺乏狀態與 IA-2A 陽性之間的關聯

由于 IA-2A-ELISA（而非 IA-2A-RIA）的存在與 SPIDDM  患者的內源性胰島素分泌較低相

關，因此我們還分析了 57  名 TIDE-J SPIDDM  患者中 F-CPR   的連續變化。 自入組后的 3     年中，57  名患者中有 32  名 (56%)  進展為胰島素缺乏狀態，定義為 F-CPR <0.6 ng/mL 5  。

桌子5顯示 SPIDDM  患者進展者和非進展者之間的臨床特征。與非進展者相比，進展者的  特點是發病年齡較小、體重指數較低、發病時糖尿病酮癥酸中毒頻率較高、入組時 F-CPR  較  低以及 GADA  頻率較高。此外，進展組中 F-CPR  較基線下降的百分比 (ΔF-CPR)  顯著低   于非進展組。進展組中 IA-2A-ELISA   陽性 SPIDDM  的頻率顯著高于非進展組（53% vs 16%，

P = 0.006），而 IA-2A-RIA   的頻率沒有差異兩組之間。此外，IA-2A-ELISA  陽性患者的平

表 5

緩慢進展 1 型糖尿病患者進展者和非進展者的臨床特征

測定相應自身抗體陽性患者的自身抗體水平。ΔF-CPR表示空腹C肽相對于基線的百分比

BMI ，身體質量指數；DKA ，糖尿病酮癥酸中毒；ELISA ，酶聯免疫吸附測定；F-CPR ，空腹

C 肽；GADA ，谷氨酸脫羧酶自身抗體；HLA ，人類白細胞抗原；不適用，不適用；NS ，不

顯著；RIA ，放射免疫分析。

IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 之間 1  型糖尿病患者 IA -2  的抗原特異性存在差異

To elucidate whether the discrepancy in IA-2A results between RIA and ELISA is associated

with non-specific binding to IA-2 antigen, we carried out competitive binding experiments

with unlabeled recombinant IA-2 protein. These experiments used 31 sera from group 2 and 22 from group 1 using the RIA method, whereas 12 sera from group 3 and 19 from group 1     were employed using the ELISA method. The percentage of inhibition was 91.3 ± 10.4% for

group 2 and 93.9 ± 5.7% for group 1 using the RIA method, and 97.7 ± 7.8% for group 3 and

100.0 ± 0.0% for group 1 using the ELISA method, respectively. Additionally, the levels of

IA-2A turned negative in all sera used in these experiments after adding 250 μg/mL of

unlabeled IA-2 protein.

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DISCUSSION                                                                                                                                                               

In the present study, we showed that: (i) the prevalence of IA-2A-ELISA was 4– 5% lower

than that of IA-2A-RIA; (ii) the concordance rate for both IA-2A assays was 90 – 95% for

type 1 diabetic patients; (iii) the IA-2A-ELISA was a more useful marker than the RIA method for identifying SPIDDM patients who progress to the insulin-deficient state at an early stage;

and (iv) both IA-2A assays detected antigen-specific autoantibodies. When measured in

combination with GADA, the two different commercial assay kits used to measure IA-2A by    RIA or ELISA were almost equivalent in diagnostic sensitivity. Therefore, as GADA is the first

anti-islet autoantibody in line to be measured under Japanese health insurance, the

IA-2A-ELISA makes for a suitable alternative method to the discontinued RIA method for the

diagnosis of autoimmune-mediated type 1 diabetes in patients with acute-onset type 1

diabetes and SPIDDM. However, it is not perfect, as we found that the correlation between  IA-2A levels by RIA and ELISA (r = 0.65–0.77) was lower than in the case of GADA-RIA and  GADA-ELISA (r > 0.8), which was consistent with a previous report1   . These results show that, in patients with type 1 diabetes, it might be difficult to estimate the IA-2A-ELISA level

from the antibody level of the IA-2A-RIA. The discordant results between the two assays

might be related to the discordant epitopes ofIA-2 peptide recognized by the RIA and the

ELISA methods, although the IA-2 molecules used in these two kits are identical.

To compare the clinical significance of IA-2A-RIA and IA-2A-ELISA, patients with type 1

diabetes were divided into four groups based on the positivity of both methods, and the

clinical characteristics in patients with acute-onset type 1 diabetes and SPIDDM were

compared (Tables3 and and4).4). In addition to a higher frequency of GADA in

IA-2A-positive patients than in IA-2A-negative patients, the IA-2A levels in group 1 were

significantly higher than in group 2 (RIA) or group 3 (ELISA) in both type 1 diabetes

subtypes. However, as both assays detected IA-2-spcific autoantibodies in our competitive binding experiment, we believe this outcome might be related to the different epitopes or

affinities of IA-2A between the patients positive for both RIA and ELISA and those with

discrepant results.

Interestingly, patients with SPIDDM who were positive for IA-2A-ELISA had a higher

frequency of HLA-DRB1*09:01 than IA-2A-ELISA-negative patients (Table4). Furthermore,

logistic regression analysis showed that IA-2A-ELISA positivity, but not IA-2A-RIA positivity,

was independently associated with the presence of HLA-DRB1*09:01 (TableS3). The

previous studies reported that HLA-DRB1*09:01 was susceptible HLA class II allele in

SPIDDM patients, and the prevalence of IA-2A was higher in those carrying

HLA-DRB1*09:0111, 12, 13  . Thus, it is speculated that the association between SPIDDM

patients and HLA-DRB1*09:01 might be due to the presence of IA-2A.

Regarding patients with SPIDDM, it is important to identify which predictive marker is best

for identifying the progression to the insulin-deficient state, as this could assist in

maintaining good glycemic control and, therefore, avoid diabetic complications. Previous

reports state that high titer, high affinity and the middle-epitope of GADA act as predictive

markers of future insulin dependency in patients with SPIDDM14, 15, 16  . Furthermore,

screening for other anti-islet autoantibodies was shown to help increase the predictive

power regarding GADA-positive SPIDDM14, 15  . As IA-2A-ELISA-positive SPIDDM

patients had a lower F-CPR than IA-2A-RIA-positive individuals in our cross-sectional

dataset, we further investigated whether IA-2A-ELISA is superior to IA-2A-RIA in predicting insulin-deficiency by using the longitudinal dataset in the TIDE-J study. As shown in Table 5, the prevalence of IA-2A-ELISA, but not IA-2A-RIA, was significantly higher in the progressor group than in the non-progressor group. Furthermore, there was a significant relationship

between ?F-CPR and IA-2A-ELISA positivity, but not IA-2A-RIA positivity. These results

suggest that IA-2A-ELISA is more useful than IA-2A-RIA in identifying high-risk SPIDDM

patients associated with the faster decline in β -cell function, as well as early progression to

the insulin-dependent state. In patients with SPIDDM, it has been reported that patients with

low-affinity anti-islet autoantibodies have prolonged preservation of residual β -cell

function16  . Furthermore, the IA-2A-ELISA used in the present study utilizes the same        principle, bivalent autoantibody method, as the RSR GADA-ELISA, which has been reported  to detect only high-affinity antibodies8   . With all these factors considered, it is speculated  that the discordance between IA-2A-ELISA and IA-2A-RIA in predicting disease progression

might be linked to the diversity of autoantibody affinity detected by each assay.

The present study had several limitations to report. First, the number of participants was

relatively small, which might affect the concordance rate and correlation between the two

assays. Therefore, further investigation using a larger cohort is required to confirm our

results. Second, the duration of type 1 diabetes after onset in participants varied from short

to long, so further investigations involving new-onset patients are necessary. Third, the

participants in this study did not include childhood-onset type 1 diabetes, so further

investigation involving those patients is warranted.

In summary, the present study showed that the IA-2A-ELISA is a reliable marker not only for

the diagnosis of type 1 diabetes, but also for the prediction of SPIDDM progression when

compared with the IA-2A-RIA. We conclude that using ELISA to detect IA-2A might help

identify a subtype of SPIDDM patients who would likely progress onto an insulin-deficient

state.

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DISCLOSURE                                                                                                                                                              

Akihisa Imagawa received honorarium or consultation fees from Astellas Pharma Inc.; grants

or research support from Astra Zeneca K. K., Taiho Pharmaceutical Co., Ltd., Daiichi Sankyo

Co., Ltd., Merck Biopharma Co., Ltd., Parexel International Inc., Shionogi Co., Ltd., Sumitomo

Dainippon Pharma Co., Ltd. and Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.; Daisuke Chujo received

honorarium for lectures from Eli Lilly and Company, Tomoyasu Fukui received research

funding from Cosmic Corp. Junnosuke Miura received honorarium for lectures from Taisho     Pharmaceutical Co., Ltd., Novo Nordisk Pharma Ltd., Novartis Pharma KK, Eli Lilly Japan K.K.,

Sanofi K.K., Johnson & Johnson K.K., Abbott Japan LLC, Terumo Corporation, Boehringer

Ingelheim Co., Ltd., Kyowa Kirin Co., Ltd., Takeda Pharmaceutical Company Limited,

Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, MSD K.K., Mylan EPD G.K., Kowa Company, Ltd.,

Astra Zeneca K.K. and Astellas Pharma Inc.; medical consult fees from Kanro Inc.; and

manuscript fees from Novo Nordisk Pharma Ltd. The other authors declare no conflict of

interest.

Approval of the research protocol: This study protocol was approved by the Ethics

Committee of Japan Diabetes Society.

Informed consent: Informed consent was obtained from all participants.

Registry and the registration no. of the study/trial: Approval date of Registry 1 November

2018, and approval number 30-008-(2).

Animal studies: N/A.